Le séquençage du génome humain - Maxicours

Le séquençage du génome humain

Objectifs
  • Comprendre les enjeux du séquençage des génomes.
  • Situer le séquençage du génome humain dans l’histoire des Sciences.
  • Comprendre le principe du séquençage de l’ADN.
  • Comprendre les avantages des nouvelles technologies en matière de séquençage.
Points clés

La molécule d’ADN est le support de l’information génétique et les mécanismes à l’origine de la réplication ont permis d’imaginer un processus de séquençage de la molécule d’ADN. Les nucléotides peuvent être modifiés de telle sorte que leur incorporation bloque la poursuite de l’élongation du brin d’ADN. La relation entre la taille du fragment obtenu et la nature du dernier nucléotide incorporé permet de déduire la séquence du brin d’ADN.

La détermination de la séquence des génomes permet de mieux comprendre leur fonctionnement et les conditions d’expression des gènes. Ces connaissances sont essentielles pour l’étude des maladies génétiques et sont un outil important en phylogénie.

Pour bien comprendre
  • La structure de la molécule d’ADN.
  • Le principe de la réplication de l’ADN et le rôle de l’ADN polymérase.
1. Histoire du séquençage du génome humain
a. Les grandes dates

Depuis les travaux de Watson et Cricks (1953), les scientifiques connaissent les caractéristiques structurales de la molécule d’ADN, porteuse de l’information génétique. Ils en ont décrypté les mécanismes de réplication et de transcription ainsi que ceux permettant leur traduction en protéines. La connaissance précise de la séquence des génomes constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension de certaines maladies.

Dans un premier temps, les généticiens déterminent la carte génétique des génomes permettant de localiser précisément les gènes sur les différents chromosomes. La première carte génétique humaine est établie en 1985. Pour cela, ils ont fractionné les chromosomes en grands fragments afin d’y localiser les séquences codantes correspondant aux gènes.

Dans un second temps, cette carte est affinée grâce à une fragmentation plus fine des chromosomes (100 000 nucléotides par fragments). C’est ainsi que la première carte physique humaine fut établie en 1995.

En parallèle, certains scientifiques s’attellent au séquençage de petits génomes (virus, levure, nématode, drosophile, etc.). Puis le séquençage du génome humain est amorcé en 1997. C’est un immense projet qui regroupe un grand nombre de laboratoires et de nationalités appelé le projet « génome humain ».

b. Le projet « génome humain »

Le génome humain est long d’environ 3,2 milliards de nucléotides. Pour pouvoir obtenir la séquence complète, des échantillons d’ADN sont récoltés auprès d’une trentaine de donneurs anonymes. Les chromosomes sont isolés afin de pouvoir extraire l’ADN génomique. Ce dernier est ensuite fragmenté puis, chaque fragment est cloné dans un plasmide (petit chromosome bactérien) afin de pouvoir être amplifié. Chaque fragment peut alors être séquencé individuellement. La séquence complète du génome est ensuite reconstituée par superposition des séquences nucléotidiques communes retrouvées dans les différents clones. 


Technique du séquençage

Ces nouvelles connaissances permettent aujourd’hui aux scientifiques d’explorer l’ensemble du génome afin de mieux comprendre sa composition et le rôle des différentes séquences dans la régulation de l’expression des gènes. De plus, ces technologies sont des outils indispensables pour la compréhension des maladies génétiques ainsi que dans les études phylogénétiques.

Le séquençage complet du génome humain a été achevé en 2004. Par contre, le séquençage coûte très cher. Aussi, un grand nombre de laboratoire se regroupent en réseau ou pôle de recherche afin de partager les frais. De grands centres spécialisés dans le séquençage voient le jour comme le Genopole Français construit en région parisienne en 1998. Il constitue aujourd’hui un centre de recherche dédié à la génomique, génétique et aux biotechnologies.

2. Principe du séquençage
a. La méthode selon Sanger

C’est en 1977 que Frederick Sanger met au point la première technique de séquençage. Elle repose sur la capacité de l’ADN polymérase à synthétiser un nouveau brin d’ADN par complémentarité.

Pour cela, on place dans 4 tubes différents un échantillon d’ADN à séquencer en présence d’une amorce complémentaire (brin d’ADN de 15 à 25 nucléotides) et les 4 désoxynucléotides, dNTPs (Adénine, Thymine, Cytosine et Guanine). Puis, dans chacun des tubes on ajoute un didésoxynucléotide (ddNTP) terminateur marqué radioactivement qui ne permet pas la poursuite de l’élongation par l’ADN polymérase. Ainsi, dans le premier tube, on ajoute une Adénine modifiée, dans le second tube une Thymine, dans le troisième tube une Cytosine et dans le quatrième tube une Guanine. On ajoute alors l’enzyme et on laisse la polymérisation du nouveau brin se faire.

À l’issue de la réaction, les fragments d’ADN néosynthétisés sont séparés sur un gel dont le maillage permet de séparer des fragments dont la taille diffère seulement d’un nucléotide. Les plus petits fragments migrent les plus vite tandis que les plus gros fragments migrent lentement. Les fragments sont ensuite visualisés grâce à leur marquage radioactif et la lecture de la séquence se fait directement sur le gel.


Méthode Sanger
b. Les nouvelles technologies

Le séquençage est une technique lourde est coûteuse mais qui a beaucoup évolué depuis Sanger. Aujourd’hui, le séquençage est automatisé et son coût a pu être réduit. Toutefois, l’acquisition d’un séquenceur coûte cher et nécessite le regroupement de plusieurs laboratoires en Centre de recherche. Le séquençage automatique utilise des didésoxynucléotides couplés à des fluorochromes. La synthèse a lieu en présence des 4 nucléotides normaux et des 4 ddNTPs marqués. Les fragments obtenus sont ensuite séparés par chromatographie. À la sortie de la colonne de chromatographie, un lecteur détecte la nature de la fluorescence et la taille du fragment. Le résultat est obtenu sous la forme de graphiques dont chaque pic correspond à un nucléotide. La lecture de la séquence est donc plus rapide. De plus, cette méthode permet le séquençage de fragments plus longs.


Exemple de résultat de séquençage

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